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值得一看,智能色谱

来源:http://www.paisapatin.com 作者:云顶国际 时间:2019-06-25 02:30

提到色谱仪对不从事化学有关问题的人来说可能还有些陌生,但是“色谱”一词的出现已经有近100年的历史了,而且从现代科学技术意义上说的商品色谱仪的使用也有近半个世纪了。色谱方法和色谱仪科学技术的发展、为国民经济的增长、为人民的健康长寿、特别是为揭示生命奥密作出了的贡献。
俄国植物学家茨维特茨维特于1903年在波兰华沙大学研究植物叶子的组成时,他巧妙地用碳酸钙作吸附剂,分离植物干燥叶子的石油醚萃取物,他把干燥的碳酸钙粉末装到一根细长的玻璃管中,然后把植物叶子的石油醚萃取液倒到管中的碳酸钙上,萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里,再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素,于是在管内的碳酸钙上形成绿、黄等三种颜色的六个色带,分离了叶绿素、叶黄素和胡萝卜素。当时茨维特把这种色带叫作“色谱”,茨维特把他开创的方法叫色谱法,或者后来人们把这一方法叫做液-固色谱发。在这一方法中把玻璃管叫作“色谱柱”,碳酸钙叫作“固定相”,纯净的石油醚叫作“流动相”。这是利用色谱方法为探究生命现象的启蒙和开端。
在茨维特提出色谱概念后的20多年里没有人关注这一伟大的发明。直到1931年德国的库恩等才重复了茨维特的某些实验,用氧化铝和碳酸钙分离了α-,β-,和γ-胡萝卜素,此后用这种方法分离了60多种这类色素,1938年他从维生素B中分离出B6,由于他的出色研究而获得了1938年的诺贝尔化学奖。这是利用色谱方法为探究生命现象、了解生物物体构成的初步尝试。接下来在40年代到50年代初,英国的生物化学家马丁等在研究生物体重要组成脂肪酸和脂肪胺时开创了以气体作流动相以液体做固定相的气-液色谱法,因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。1958年美国生物化学家Stein和Moore研制出氨基酸分析仪,用它确定了核糖核酸酶的分子结构,后来氨基酸分析仪成为研究蛋白质和酶结构的重要工具,Stein和Moore因此而获得了1972年的诺贝尔化学奖。
从上面的几件历史事件看出色谱分离方法和色谱仪是为揭示生命奥密而出现的。而在20世纪末的人类基因组计划的提前完成和21世纪初蛋白质组学的大力开展,色谱方法和色谱仪又作出了令人鼓舞的贡献。
2000年6月宣布人类基因组计划已经完成了其工作草图,因此,科学家们认为,生命科学已经进入了功能基因组时代,在功能基因组时代,生物学家们的研究重心从揭示生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对生物功能的研究。2001年2月12日,中、美、日、德、法、英等6国科学家和美国塞莱拉公司今天联合公布人类基因组图谱及初步分析结果。这一计划所以能够提前完成,其主要原因之一就是使用了高通量的阵列毛细管电泳仪,这一仪器是也是一种属于色谱仪范畴的仪器。
从基因组DNA序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰的情况、以及它们的亚细胞分布等等。这些在基因组中不能解决的问题可望在蛋白质组学研究中找到答案。在所研究的细胞中会有3—5万种蛋白质,目前蛋白质组研究所使用的双向电泳一般只能分辨到2000—3000个蛋白质点。在蛋白质组的分析中有望用液相色谱作预分离,即使用双向HPLC,向是体积排阻色谱。所以双向电泳和液相色谱将成为蛋白质组学的重要分离工具。所以色谱仪将为深入地揭示生命奥秘作出更大的贡献。
从色谱出现的百年历史说明,色谱仪是揭开生命奥秘的有力工具。色谱仪大致包括气相色谱仪、液相色谱仪、离子色谱仪、超临界流体色谱仪、毛细管电泳仪等等。前两种色谱仪是应用为广泛和应用十分成功的两类仪器,可以分析气体、液体、固体等复杂混合物。离子色谱仪也逐渐普及地用于各个领域。超临界流体色谱仪应用范围较小还不普及。毛细管电泳仪是20世纪80年代后发展起来的一种分离仪器在生命科学领域有极大的应用前景。

分析就是要确定是什么(定性)和有多少(定量)。定性分析中,若只要求确定元素的组成(如无机定性分析),则可选用发射光谱分析等方法仅需一次测定就可以得到多种元素的分析结果。但一般情况下,分析对象是由各种元素组成的化合物,为数不多的几种元素即可组成许多化合物,尤其在有机化合物中,由碳、氢、氮、氧、硫和卤素等几种元素可以组成数百万种化合物。仅用一种分析装置就能分析这些混合物的仪器至今还没有。分析混合物,必须利用各组分之间的某种物理和化学行为的差异,逐一分离各组分,测定其构成元素的种类、各元素原子的数目、结合状态、分子的立体构型和相对分子质量等,再鉴定其组分。若能分离出需要量(几十毫克)的纯化合物组分,则用现代鉴定方法(如质谱分析、核磁共振分析、红外吸收分析、元素分析、X射线分析等)就能确定结构。反之,当待测样品中含有多种化合物时,即使用上述方法,也不可能对各种组分进行识别和鉴定。因此,在使用这些分析仪器之前,除去于扰物,分离出分析仪器检测极限以内的纯品量的前处理工作是必不可少的。

色谱(Chromatography)是什么?

   5月21日,国际化学顶级杂志《德国应用化学》在线刊发了生命学院刘笔锋教授团队的重要研究成果,论文题为“基于活性探针的单细胞化学蛋白质组学:鉴定原代神经元低拷贝膜蛋白”。

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  据介绍,随着人类基因组计划的完成,从系统生物学角度认识生命现象的本质规律已成为新的科学范式之一,各种组学如基因组学、蛋白质组学和代谢组学等的发展方兴未艾。由于细胞间的个体差异性,在单个细胞水平探讨生命过程的物质基础是近年来的热点问题,例如当下如火如荼的单细胞基因组学和单细胞测序计划。刘笔锋教授团队在2013年提出了基于微流控芯片的超高通量单细胞基因组学新方法研究环境胁迫下的基因组损伤,研究结果发表在国际分析化学顶级期刊美国《分析化学》上。由于蛋白质组的复杂性,相比与单细胞基因组,单细胞蛋白质组学要困难得多。2004年美国Dovichi研究小组率先提出并建立了化学细胞术方法,首次成功地获得了单个细胞水平的蛋白质组指纹谱;同时,美国Nolan小组提出了基于多参数流式细胞术的单细胞蛋白质组方法,被评价为寻找细胞信号网络尤其是癌症相关信号网络的金钥匙。

19世纪,色谱法被化学家使用。首先对色谱法进行详细描述的是俄国植物学家茨维特(Tswett)。1906年,茨维特在研究植物色素的组成时,把含植物色素,即叶绿素的石油醚提取液注入一根装有CaCO3颗粒的竖直玻璃管中,提取液中的色素被吸附在CaCO3颗粒上,再加入纯石油醚,任其自由流下,经过一段时间以后,叶绿素中的各种成分就逐渐分开,在玻璃管中形成了不同颜色的谱带,“色谱”(即有色的谱带)一词由此而得名。用机械方法将吸附色素的区带依次推出,各个区带的色素再分别用适当的溶剂洗脱下来。这种分离方法称为色谱法,这根玻璃管称为色谱柱。

在高中的生物课实验中,有一个叶绿素的实验。在实验中,我们将新鲜叶子研磨过滤后的液体,在滤纸上均匀地划一条,放在四氯化碳和无水硫酸钠的液体中,过一小时左右,在滤纸的上方我们就能看到四种颜色,从上到下分别为胡萝卜素、叶黄素、叶绿素A、叶绿素B。这个就是我在实验室最早接触到的色谱。

  本论文第一次提出了基于化学生物学手段的单细胞功能蛋白质组学研究新方法,将微流控芯片单细胞处理能力与毛细管电泳-激光诱导荧光高分辨率高灵敏度相结合,成功地在单细胞水平解读出小鼠颗粒神经元膜表面低丰度GB1受体及其可变剪切体的表达。

上述分离方法属于吸附色谱法。茨维特用这一方法证明了叶绿素不是一种单一的物质,而是一种混合物。这一出色的工作,不仅破除了当时普遍认为叶绿素是一种单一物质的陈腐观念,而且为色谱法的创立奠定了坚实的科学基础。茨维特认为,当混合物溶液流经吸附柱时,色素即被分成不同颜色的区带,复杂色素中的各个成分依次有规律地分布在色谱柱上,这样就有可能对它们进行定性和定量分析,这种分析方法称为色谱分析法。

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  该项研究成果是刘笔锋教授团队与该院刘剑峰教授团队和中科院上海药物所南发俊研究员团队通力合作下完成的。该项目获得国家科技部“973”项目和国家自然科学基金项目资助。

Chromatography(色谱法)由希腊词chromatus(颜色)和graphein(记录)合并而成。以后的研究和应用说明,无颜色的物质也可以用色谱法分离。

其实100多年前俄国科学家Tswett(茨维特)就一直在进行类似的实验,他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带化合物得以分离。

茨维特的这一发现不但引起了人们的注意,而且人们还对这种分离技术进行了不断地研究与应用。1935年人工合成离子交换树脂的成功为离子交换色谱的广泛应用提供了物质基础。1938年苏联lzmailov等创立了薄层色谱法,并将此法用于药物分析。薄层色谱法用于无机物的分析是从20世纪50年代末开始的,而应用于稀土元素的分离则是在1964年由Pierce开始的。

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1941年Martin和Synge把含有一定量水分的硅胶填充到色谱柱中,然后将氨基酸的混合物溶液加入柱中,再用氯仿(三氯甲烷)淋洗,结果各种氨基酸得到分离。这种实验方法与茨维特的方法虽然在形式上相同,但是其分离原理完全不同,这种分离方法称为分配色谱法。

由于在这个实验中,我们肉眼通过颜色来区分谱带,而希腊语中颜色为 Chromato 、图像为Graphy 。

1944年,Consden, Cordon和Martin首先描述了纸色谱法。Martin和Synge用此法成功地分离了氨基酸的各种成分。

那么色谱就是Chromatography,这个词来源于希腊字 chroma和 graphein,直译成英文时为 color和writing两个字;直译成中文为色谱法。但也有人意译为色层法或层析法。

1947年美国的Boyd和Speding等发表了一系列论文,报道了他们应用离子交换色谱法分离裂变产物和稀土元素混合物的情况。

而将植物色素提取物的分离过程,总结一下就是:利用植物色素各成分在石油醚和碳酸钙的吸附溶解的能力不同,使得各成分逐渐分开。

1952年Martin和Synge成功研究出气-液色谱法,并将蒸馏塔板理论应用到色谱分离中,进一步推动了色谱法的发展,目前这一方法已在科学研究和工业上得到了广泛应用,特别是在有机物的分析方面应用更加普遍。Martin和Synge也因在色谱法的研究中作出的重大贡献而荣获1952年的诺贝尔化学奖。

那么,色谱法就是是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。两相中有一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase),有一相是流动的,称为流动相(Mobile Phase)。

1956年荷兰学者van Deemter在总结前人经验的基础上提出范第姆特方程,使气相色谱的理论更加完善。1957年,Golay发明了高效能的毛细管柱,使色谱分离效能显著提高。20世纪50年代末,Holme、将气相色谱与质谱联用,这是近代仪器分析发展的重要标志之一。

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虽然经典的柱液色谱法能够分离性质相近的元素,但由于柱效低,分离速度慢而不能适应现代科学技术迅速发展的需要。20世纪60年代末,法国的G.Aubouin和美国的Scott等,几乎同时各自创立了高效液相色谱法。高效液相色谱法是由现代高压技术与传统的液相色谱法相结合,加上高效柱填充物和高灵敏检测器所发展起来的新型分离分析技术。由于它具有高效、快速、高灵敏度以及宽的适应范围和大的工作容量等一系列特点,为分析化学中广泛应用柱液相色谱法开拓了广阔的前景。高效液相色谱法与分光光度法、库仑法、荧光法和电导法等测定方法联用,可以使分离和检测实现自动化,现在14种镧系元素可以在17min内达到定量分离。由于各种新色谱填充剂的研制成功以及新色谱技术的发展,高效液相色谱法已发展成为一种强有力的分离和分析手段,其发展速度已超过气相色谱,并实现了高效液相色谱一质谱联用。近年来高效液相色谱法广泛应用于医学化学、药学、环境化学等领域,此色谱法已成为极其有效的分析方法,对科学的发展作出了重大的贡献。

色谱法是分析化学中发展最快、应用最广的方法之一。现代色谱法具有分离与在线分析两种功能,不仅能解决复杂物质的分离、定性和定量分析的问题,而且还具有分离制备纯组分的功能。色谱法在对复杂物质分离分析上具有其他技术不可替代的强大功能,并将不断发展。

色谱法与其他分析方法的联用,促使分析灵敏度提高、鉴别能力增强、分析速度加快,而得到的大量数据需要电子计算机进行计算和存储,这促使色谱技术与电子计算机紧密结合起来,进一步促进了色谱与其他分析仪器联用技术的发展。

根据中国政府采购网发布的中标信息,据不完全统计,2017年1月1日至12月27日色谱相关有效招标采购中标项目约为290多项。其中,不完全统计到的相关色谱(包括气相色谱、液相色谱、离子色谱、薄层色谱及其他相关配件等)中标台数为410台,中标总金额近1.981亿元。

应用色谱法的目的是进行定量分析和单个分离纯物质。实际研究工作者根据分析目的,可采用气相色谱法、液相色谱法和薄层色谱法中的一种或几种相互联用。由于色谱法分析技术不断发展,这些方法所得信息的差别逐渐消失。例如,气相色谱法中填充柱的理论塔板数为1×103~2×103,柱长一般为2~3m,高效液相色谱法的理论塔板数为2×104~6×104,柱长一般为15~30cm,所以实际上两者大体上均用理论塔板数为4~103左右的色谱柱分离组分,仅从色谱峰的形状看,所得到的色谱图没有太大差别。但是,在适于分析的物质、检测方法及与其他分析仪器联用等方面,每种方法各有特点。

色谱仪器中标应用领域分布

2.世纪50年代初我国的科技工作者就开展了气相色谱的研究与应用工作,50多年来在薄层色谱、气相色谱、毛细管色谱、高效液相色谱、联用技术、毛细管电泳色谱以及智能色谱等方面都取得了很大的成就,色谱技术在科学研究和国民经济建设中发挥了重要作用。

从色谱仪器中标应用领域来看,2017年色谱仪器中标项目中应用领域最多的是制药,其比例高达27.14%。环境与生命科学领域应用比例分别为11.56%和10.74%,总体占比也较高。食品与农林领域应用比例分别为9.74%和9.53%,应用比例占比较为相近。最后,由于中标信息不完整无法统计的“其他”一项占比达31.29%,其中大多是综合性高校及第三方检测检验机构。

色谱仪器中标产品类型分布

从色谱仪器中标产品类型分布来看,2017年色谱中标仪器中标数量最多的是液相色谱仪,数量占比高达46.12%。中标金额最多的依次是安捷伦、沃特世和岛津。整体来看,气相色谱中标数量占比25.97%,相对中标比例较大。离子色谱、制备液相色谱、薄层色谱及其他配件中标数量相对较小。

值得一提的是,在液相色谱中标项目中,中标品牌多为国外企业;在气相色谱中,中标品牌依然是国外企业占比较大,只有少数国产企业冲出重围。如天美仪器、北京东西分析仪器有限公司、常州磐诺仪器有限公司等。在离子色谱中标项目中,只有青岛盛瀚色谱技术有限公司、安徽皖仪科技股份有限公司等少数几家国产企业分得“一杯羹”。

色谱仪器中标品牌分布

从云顶国际网址,色谱仪器中标品牌分布来看,2017年色谱中标仪器中进口品牌占比比例远超国产品牌占比比例。其中进口品牌仪器占比高达百分之58.32%,而国产品牌占比比例仅为9.54%。另由于中标信息不完整,有32.14%的中标产品品牌无法统计。

在进口品牌中,沃特世、赛默飞、岛津、安捷伦等品牌较受追捧。在国产品牌中,只有极少数的几家企业有进项。从台数到金额,国产与进口之间依然差距明显,近两年国产设备迈向高端呼声渐长,国内色谱仪器厂商在这方面仍将“上下而求索”。因此,我国国产仪器与进口仪器间差距较为明显,国产仪器仍然任重道远。


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